ESTIMATION OF EFFECTIVENESS OF IMMUNOSUPRESSIVE THERAPY IN PATIENTS WITH APLASTIC ANEMIA BASED ON HEMOPOESIS AND CYTOKINES

 

Aziza Makhmudova

Deputy Director for Science, MD, RSSPCH MHRUz,

Uzbekistan, Tashkent

Inna Berger

M.S., doctoral candidate, hematologist RSSPCH MHRUz,

Uzbekistan, Tashkent

 

АННОТАЦИЯ

Авторами представлены данные об эффективности применения Циклоспорина А в сравнении с традиционными методами лечения больных АА. Дана оценка цитокинового статуса при аплазии кроветворения и выяснена интенсивность синтеза интерлейкинов в зависимости от тяжести заболевания и получаемого лечения. Также сделан вывод, что динамика основных регуляторных цитокинов в процессе иммуносупрессивной терапии у пациентов с апластической анемией может служить критерием эффективности лечения и течения заболевания.

ABSTRACT

The authors presented data on the effectiveness of the use of Cyclosporin A in comparison with traditional methods of treating patients with AA. The cytokine status in case of aplasia of hematopoiesis is estimated and the intensity of the synthesis of interleukins is determined depending on the severity of the disease and the treatment received. It was also concluded that the dynamics of the main regulatory cytokines during immunosuppressive therapy in patients with aplastic anemia can serve as a criterion for the effectiveness of treatment and the course of the disease.

 

Ключевые слова: апластическая анемия, цитокины, интерлейкины, ЭПО, ФНОα, ИНФγ, циклоспорин А, глюкокортикостероиды. 

Keywords: aplastic anemia, cytokines, interleukins, EPO, TNFα, INFγ, cyclosporin A, glucocorticosteroids.

 

Апластическая анемия (АА) является довольно редким и относительно мало изученным заболеванием, для которого характерно нарушение работы костного мозга, приводящее к панцитопении, что сопровождается тяжелыми нарушениями всех систем организма и приводит к высокой инвалидизации и смертности пациентов [4].

Многие факторы влияют на работу костного мозга, одним из них являются цитокины, которые либо стимулируют его работу, либо подавляют его [5]. Все больше и больше исследователей во всем мире обращают свое внимание на изучение цитокин-опосредованных процессов при аплазии. Среди цитокинов выделяют положительные регуляторы, которые включают эритропоэтин (ЭПО), интерлейкины (ИЛ) -1, -4, -6, -8 и др., которые стимулируют дифференцировку клеток-предшественников гранулоцитопоэза, и отрицательные - интерферон (ИНФγ) и фактор некроза опухоли. (ФНОα), которые уменьшают или замедляют тромбо-, миело-, гранулопоэз [2].

На сегодняшний день изучение гемопоэтических факторов, безусловно, является одним из наиболее актуальных для заболеваний, связанных с депрессией гемопоэза, к которым относится апластическая анемия.

За последнее десятилетие сообщения по этому вопросу появились в зарубежной литературе (Teramura M., Mizoguchi N., 1996; Young N.S., 2002; Sleijfer S., Lugtenburg P.J., 2003; Dubey S. etal., 2005). Но до настоящего времени комплексная оценка степени нарушения цитокинового статуса у пациентов с АА не была дана, соотношение основных стимулирующих и негативных цитокинов в их динамике в ходе терапии не было определено, а следовательно, их значимость и место в механизме развития заболевания не определены [3].

Цель. Дать оценку проводимой иммуносупресивной терапии АА анализируя цитокиновый статус пациентов.

Научная новизна. Нами была изучена лечебная эффективность иммуносупрессивной терапии больных АА Циклоспорином А (ЦсА) в сравнении с традиционными методами лечения и дана оценка особенностей восстановления показателей гемопоэза на начальных этапах лечения.

Материалы и методы.Нами проанализированы данные, отражающие состояние 50 больных АА, получавших терапию в НИИ Гематологии и переливания крови МЗ РУз в период развернутых клинических проявлений болезни. Среди пациентов, получавших лечение, было: 31 мужчин и 19 женщин в возрасте от 19 до 65 (13,5±2,1). Среди них: впервые поступивших больных было 8, повторных – 42. Из 42 повторно поступивших, 12 (28,6%) больным в предыдущие сроки пребывания в стационаре была проведена спленэктомия.

Тяжесть заболевания определяли на основании общепринятых критериев (в зависимости от степени тяжести депрессии кроветворения) [6], согласно которым больные были разделены на две группы: тяжелая (ТАА) - 28 (56%) и нетяжелая апластическая анемия (НАА) - 22 (44%) пациентов. В зависимости от полученного лечения больные были разделены на следующие подгруппы: 25 получали Циклоспорин А, среди них 5 первичных и 20 – повторных. Глюкокортикоиды (ГКС), гемотрансфузии (ГТ) по показаниям получали 25 больных, среди которых 3 первичных и 22 – повторно поступивших. Первую группу больных условно обозначили «с ЦсА», а вторую - «без ЦсА».

Для исследования цитокинового статуса использовался метод твердофазного “сэндвича” – вариант иммуноферментного анализа, с помощью тест систем «Вектор - Бест» Россия.

Полученные цифровые показатели статистически обрабатывались на основе банка данных с использованием пакета программ MicrosoftExsel. Вероятность достоверности различий сравниваемых величин оценивали по t-критерию Стьюдента.

Результаты и обсуждение. На основании результатов исследования отмечалось, что в 100% случаев у больных с АА имелся геморрагический синдром, который выражался десневыми (78%), носовыми (44%), маточными кровотечениями (8%) и в 100% случаев – геморрагиямина коже и в слизистые.

В исходном состоянии у всех больных выявлена анемия различной степени тяжести. Значения цветового показателя свидетельствовали о нормохромномхарактере анемии у большинства больных.  Уровень гемоглобина колебался от 36 до 102 г/л (в среднем 72 ± 14,9 г/л) в группе больных с ТАА и от 80 до 98 г/л (в среднем 89,6 ± 13,3 г/л) – в группе больных с НАА.

При изучении состояния костного мозга у больных АА в стадии разгара заболевания было отмечено следующее: у 47 больных отмечалась гипоклеточность костного мозга, у 3 – нормоклеточность. Тип кроветворения - нормобластический, красный и гранулоцитарный росток сужены в границах, отмечалось замещение их жировыми клетками. У 39 больных было значительно увеличено количество лимфоцитов, у 11 – умеренно.  Мегакариоцитов не было найдено у 28 (56%) больных, у 22 (44%) – в малом количестве, но все они были недеятельные и без отшнуровки.

Изучение показателей гемопоэза проводилось накануне курса лечения и перед выпиской из стационара.

Для оценки степени ответа на лечение мы использовали следующие критерии [6]:

1. Полная клинико-гематологическая ремиссия:

- уровень гемоглобина> 100 г/л,

- количество гранулоцитов в циркуляции >1,0*109/л,

- количество тромбоцитов> 80*109/л.

2. Клинико-гематологическая компенсация:

- уровень гемоглобина не менее 80 г/л,

- количество гранулоцитов в циркуляции >0,5*109/л,

- количество тромбоцитов> 20*109/л,

- полностью отсутствуют геморрагические проявления,

- сохраняется потребность в трансфузиях эритромассы.

3. Отсутствие ответа.

При изучении гемопоэза у всех больных АА в гемограмме перед курсом лечения отмечалась панцитопения, которая сохранялась (по средним показателям) на том же уровне через месяц от начала курсов иммуносупрессии и ГКС, исключение составляли лишь показатели эритропоэза (табл. 1)

Таблица 1.

Показатели гемограммы у больных АА до и через 2 месяца поле начала лечения

Вид лечения

Группы б-х

 

Показатели

Hb до леч.,

г/л

Hb ч/з 2 мес. леч, г/л

Лейк до леч.,

*10^9/л

Лейк ч/з 2 мес. леч,

*10^9/л

 

Тр-ты до леч, *10^9/л

Тр-ты

ч/з 2 мес.леч, *10^9/л

ЦсА

ТАА

42,9±2,6

86,5±4,3**

1,1±0,3

3,05±0,3

4,4±1,1

45,9±1,3

НАА

68,7±2,3

88,2±9**

1,5±0,5

4,1±0,8

9±2,6

55,8±1,8

без ЦсА

ТАА

44±3,6

65,8±6,8*

1,1±0,3

1,2±0,8

6,9±2,1

 15,3±2,3

НАА

51,8±6,7

80,5±2,3**

1,5±0,7

1,9±0,9

12,8±5

32,8±7,1

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,001.

 

Согласно степени оценки ответа на лечение, используя вышеуказанные критерии, были получены следующие результаты в % отношении (табл. 2).

Таблица 2.

Параметры ОАК после 2 месяца лечения больных АА

Вид лечения

Группа больных

Гемоглобин г/л

Лейкоциты 10^9/л

Тромбоциты 10^9/л

Потреб. в трансфузиях

>100

> 80

>1.0

>0.5

>50

>100

ЦcА

ТАА (19)

42%

32%

100%

0%

5%

0%

26%

НАА (6)

50%

33,3%

100%

0%

22%

0%

16,6%

Без ЦcА

ТАА (9)

0%

33%

88,9%

0%

0%

0%

67%

НАА (16)

0%

62,5%

93.7%

0%

6,2%

0%

37,5%

Примечание: % - оценка степени ответа на лечение по данному критерию

 

Рассмотрим результаты лечения (рис 1). У 19 больных ТАА на ЦсА наблюдалась положительная динамика количества эритроцитов и уровня гемоглобина в 74% случаев.  В этой группе у 42% больных отмечалось повышение гемоглобина крови выше 100 г/л, а у 32% – не менее 80 г/л. Потребность в гемотрансфузии составила 26% уже спустя 2 месяца после лечения ЦсА. Причем, у 5 первичных больных с ТАА уровень гемоглобина крови выше 100 г/л был отмечен в 100% случаев и эти больные не нуждались в гемотрансфузиях.

У 6 больных с НАА после лечения Циклоспорином А, показатели эритропоэза оказались выше, чем при ТАА – у 50% выше 100 г/л, а у 33,3% – не менее 80 г/л. Поэтому через 2 месяца от начала лечения лишь 16,6% больных имели потребность в трансфузионной терапии.

Традиционный метод лечения («без ЦсА») получали 25 больных: 9 - с ТАА и 16 – с НАА. Результаты лечения были следующими. Ни у одного больного гемоглобин не поднялся до уровня 100 г/л, лишь у 34% достиг уровня «не менее 80 г/л». Чуть лучшие результаты были достигнуты у 16 больных с НАА. Здесь у 62,5% больных гемоглобин повысился до нижнего критериального уровня (80 г/л). Поэтому больные, не получавшие ЦсА, нуждались в дальнейшем в гемотрансфузиях: пациенты с ТАА – в 67%, а с НАА – 37,5% случаев. 

Количество гранулоцитов в циркуляции практически во всех рассматриваемых группах (в 88,9-100% случаев) через 2 мес. от начала лечения сохранялось на исходном уровне (р>0,05), однако выше критического (>1,0*109/л,), кроме 6 больных с НАА, получавших ЦсА, где число лейкоцитов через 1 мес. от начала лечения увеличилось в 1,6 раза, но среднестатистически не достоверно (р>0,05).

Число тромбоцитов практически во всех группах больных с АА через 2 мес. от начала лечения продолжало оставаться на исходном уровне - от единичных до 20*10^9/л (р>0,05).

Таким образом, в результате стабилизации гемоглобина (>100 г/л), отсутствия клинически значимой нейтропении и геморрагического синдрома, а также малой потребности в гемотрансфузиях (16,6-26%), можно считать, что все больные АА (ТАА и НАА) через 2 мес. после начала лечения ЦсА успешно прошли первый этап терапии. У больных АА (с ТАА и с НАА), не получавших ЦсА, отмечался рост уровня гемоглобина, не достигающий критерия (>100 г/л), отсутствовала клинически значимая нейтропения, имелся геморрагический синдром и сохранялась еще высокая потребность в гемотрансфузиях (37,5-67%) (см. рис. 1)

 

Рисунок 1. Лабораторные критерии динамики лечения

 

ЦсА первоначально применяли в дозе 5 мг/кг веса больного [1]. Если при приеме препарата в этой дозе отсутствовали какие-либо осложнения— со стороны почечных и печеночных показателей; диспептических проявлений, гингивита, повышения артериального давления, развитие носовых, десневых и других кровотечений в течение 2 нед., больного переводили на дозу 3 мг/кг и наблюдали амбулаторно с еженедельным контролем клинического анализа периферической крови 1 раз в 2 нед.

Эффективность ЦсА оценивали в первые 1,5–2 мес. от начала приема препарата. При этом мы наблюдали улучшение состояния пациентов, уменьшение геморрагических высыпаний и рост гемоглобина и числа эритроцитов. Затем, через 3–4 месяца отмечалась нормализация числа гранулоцитов и снижение лимфоцитов.  В результате проводимого лечения клинический ответ был получен у 19(76%) пациентов. Из них, у 1 удалось добиться полной клинико-гематологической ремиссии, частичная ремиссия наблюдалась у 6 (24%) пациентов, у 11 (44%) клиническое улучшение. У 6 (24%) больных эффект на лечение ЦсА отсутствовал, хотя отмечалось улучшение состояния и снижение тяжести геморрагических проявлений. Продолжительность терапии ЦсА у пациентов, достигших полной или частичной ремиссии, составляла не менее 6 мес. При прекращении лечения у пациентов наблюдалось ухудшение показателей крови с падением уровня гемоглобина и числа тромбоцитов.

У 25 больных АА (14 мужчин и 11 женщин) после применения ЦсА проведен количественный анализ ЭПО, ИЛ-1,-4,-6,-8, ИНФγ, ФНОα, а также 25 пациентам получавшим лечение по стандартной схеме ГКС+заместительная терапия (табл. 3).

Таблица 3.

Динамика цитокинового статуса до и после лечения Циклоспорином А

Цитокины (N)

1. До начала лечения(n=50)

2. После 6 месяцев лечения ЦсА (n=25)

3. После 6 месяцев лечения  безЦсА (n=25)

P1-2

P1-3

P2-3

Спонт. (пг/мл)

Спонт. (пг/мл)

Спонт. (пг/мл)

ИЛ-1β(0-10)

10,6±4,8

9,8±2,1

10±1,8

>0,05

>0,05

>0,05

ИЛ-6 (0-10)

41,2±9,9

29,3±4,5

36,1±6,2

<0,001

<0,001

<0,05

ИНФγ (0-5)

9,1±1,1

7,2±1,1

8,3±1,15

<0,001

<0,001

<0,05

ФНОα (0-6)

14,2±4,4

10,2±1,5

12,3±3,4

<0,001

<0,001

<0,05

ИЛ-4 (0-10)

0,1±0,05

2,2±0,5

0,8±0,01

>0,05

>0,05

>0,05

ИЛ-8 (0-10)

45,3±3,15

32,2±6,17

35,8±4,5

<0,001

<0,001

<0,05

 

Анализ динамики основных регуляторов гемопоэза и процессе иммуносупрессивной терапии больных АА, позволяет сделать вывод, что успешному лечению с последующим выходом и частичную или полную клинико-гематологическую ремиссию, сопутствует снижение сверхвысокой   интенсивности   синтеза   негативного   регулятора гемопоэза ФНОα.

Как видно из таблицы 3 уровень ФНОα достоверно снизился при лечении как с ЦсА, так и при приеме ГКС и составил10,2±1,5пг/мл и 12,3±3,4пг/мл соответственно. (Р<0,001).Менее существенной оказалась разница в исследовании ИНФγ, уровень достоверности между группами - <0,05 и составил 7,2±1,1пг/мл у пациентов получавших ЦсА и 8,3±1,15пг/мл на стандартном протоколе. При анализе фактора   роста   Т-лимфоцитов ИЛ-4мы наблюдали повышение   исходно   сниженной его продукции, у пациентов получающих циклоспорин А результат был 2,2±0,5пг/мл, т.е. практически равен норме здорового человека, тогда как у пациентов на стандартной терапии, он оставался довольно низким - 0,8±0,01пг/мл. Уровень спонтанной продукции другого позитивного фактора ИЛ-6, который был повышен в 17 раз по сравнению с нормой (41,2±9,9пг/мл.) после лечения составил 29,3±4,5пг/мл у больных принимавших ЦсА и 36,1±6,2пг/мл на стандартной терапии.Что касается спонтанной продукции ИЛ-8 в периферической крови, у пациентов с АА он в 13 раз превышал показатели здорового человека (45,3±3,15пг/мл). После лечения он также оставался на высоком уровне, что по видимому требует большего количества времени для его снижения, так как он является показателем активно идущего воспалительного процесса. Тем самым у пациентов получавших ЦсА он составил 32,2±6,1715 пг/мл и 35,8±4,5 пг/мл на стандартной терапии (Р1-2<0,001; Р1-3<0,001;Р2-3<0,05)

Также  наблюдалось восстановление соотношения уровней спонтанной продукции ИЛ-1β, то есть нормализация не только интенсивности синтеза,  но  и  реактогенного потенциала клеток в отношении данного цитокина.

 

Рисунок 2. Динамика спонтанной и индуцированной продукции ФНОα мононуклеарами периферической крови больных АА при иммуносупрессивной терапии

 

Анализ соотношения основных оппозитных цитокинов в динамике заболевания (ремиссии и рецидиве), а также соответствующие этим двум стадиям изменения иммунофенотипической характеристики цитокин продуцирующих клеток позволили выявить определенные закономерности.

Как было установлено, при АА приоритеты в продукции цитокинов, в отличие от нормы, перемещаются с ИЛ-6 в сторону ФНОα, а уровень продукции ФНОα достоверно коррелирует с уровнем маркера активации мононуклеаров периферической крови. При неэффективной иммуносупресивной терапии наблюдалось дальнейшее повышение интенсивности синтеза ФНОα и ИНФγ, дальнейший подъем уровня спонтанной продукции ИЛ-1β и ИЛ-6 с ослаблением их реактогенного потенциала.

Таким образом, динамика основных регуляторных цитокинов в процессе иммуносупрессивной терапии больных апластической анемией может служить критерием эффективности проводимого лечения и течения заболевания.

На основании проведенных исследований, были сделаны следующие выводы:

  1. Лечебная эффективность ЦсА, в сравнении с традиционными методами лечения больных АА, обусловливается восстановлением показателей гемопоэза и более, чем в 2 раза снижением потребности в гемотрансфузиях уже на начальных этапах терапии. Однако судить о достижении частичной или полной ремиссии можно только после проведения лабораторного контроля гемопоэза по окончании полного курса лечения.
  2. Уровень ЭПО и продукция мононуклеарами периферической крови позитивных гемопоэтических факторов: ЭПО, ИЛ-1β, ИЛ-8 и ИЛ-6 при АА являются повышенными и не имеют патогенетического значения в развитии аплазии кроветворения. Аплазия кроветворения связана с тем, что мононуклеары периферической крови продуцируют сверхвысокое количество ингибирующего гемопоэз цитокина ФНОα и высокое количество ИНФγ.
  3. У больных АА интенсивность синтеза позитивных факторов ИЛ-6 и ИЛ-8 превалирует над синтезом других цитокинов, тогда как в синтезе негативных цитокинов значительно превалирует ФНОα, обуславливающий, по-видимому, тяжесть поражения гемопоэза.
  4. Анализируя цитокиновый статус пациентов можно сделать заключение, что больные получающие ЦсА имели более выраженное восстановление цитокинового статуса, чем пациенты на стандартной терапии.
  5. Динамика основных регуляторных цитокинов в процессе иммуносупресивной терапии у пациентов с апластической анемией может служить критерием эффективности лечения и течения заболевания.

 

Список литературы:

  1. Михайлова Е.А., Савченко В.Г., Устинова Е.Н. Эффективность ЦсА в лечении взрослых больных апластической анемией. // Терапевт, архив. 2001.-Т.73,№7.-С.56-61.
  2. Розанова О.Е. Способность мононулкеаров периферической крови и костного мозга больных апластической анемией к продукции мультиколониестимулирующего фактора интерлейкина-3 // Медицинская иммунология. 2005 - Т. 7, № 4. - С. 421-424.
  3. Розанова О.Е. Цитокинопосредованные аспекты иммунопатогенеза апластической анемии // Цитокины и воспаление. 2005. - Т. 4, № 4. - С.34-38.
  4. Скворцов В.В., Тумаренко А.В. Современные проблемы диагностики и лечения апластической  анемии //Терапевт. - 2010. - N 3. - С. 31-36.
  5. Шишина Р.Н. Апластическая анемия (патогенез, клиника и лечение). Диссертация док.мед.наук, М., 1999, 398 с.
  6. Bacigalupo A. Aplasnic anemia: pathogenesis and treatment // Hematology. 2007/Vol.1.P.23-28.