COMPARATIVE ESTIMATION OF MESENCHYMAL STEM CELL SOURCES: BONE MARROW AND ADIPOSE TISSUE

 

Constantin Zaitsev

Ph.D. in Medical Science, Head of  Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Igor Khlusov

professor, Ph.D. in Medical Science, Leading researcher of  Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Oksana Zhukova

Ph.D. in Medical Science, Leading researcher of  Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Alena Gostyukhina

Ph.D. in Biological Science, researcher of Experimental Laboratory of Biomedical Technologies of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Natal’ya Abdulkina

Ph.D. in Medical Science, Deputy general director for research and clinical work of Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk

Victor Vorob’ev

Ph.D. in Medical Science, General director of  Siberian Federal Science-clinical Center of Federal medicobiological agency,

Russia, Tomsk region, Seversk

 

АННОТАЦИЯ

Исследование было посвящено определению оптимального источника получения аутологичного клеточного материала. Объектом исследования являлись костный мозг и жировая ткань 10 половозрелых крыс линии Wistar. Установлено, что из мононуклеарной фракции костного мозга и стромально-фаскулярной фракции жировой ткани лабораторных крыс в условиях in vitro были получены культуры мезенхимальных стволовых клеток с уровнем жизнеспособности более 85%. Сравнительный анализ продемонстрировал наилучшую эффективность по показателю выхода конечного продукта для жировой ткани.

ABSTRACT

The study has been devoted to determination of the optimal source of autologous cell material. The object of the study was bone marrow and adipose tissue of 10 rats Wistar. It has been found that cultures of mesenchymal stem cells with a viability level of more than 85% were obtained in vitro from the mononuclear fraction of bone marrow and adipose stromal-vascular fraction of laboratory rats. The comparative analysis demonstrated the best efficiency in terms of the final product yield for adipose tissue.

 

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, костный мозг, жировая ткань.

Keywords: mesenchymal stem cells, bone marrow, adipose tissue.

 

За последние годы успехи в области экспериментальной эмбриологии, цитологии, молекулярной генетики и генной инженерии привели к формированию новой области – регенеративной медицины, включающей в себя научно обоснованные подходы, методы и технологии сохранения, восстановления и управляемой регенерации тканей и органов, структур и функций, используя стволовые клетки [3].

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются наиболее зрелым типом стволовых клеток, которые обнаруживаются в виде редких включений во многих тканях и органах сформировавшегося плода и взрослого организма [4]. Одна из проблем использования МСК для клеточной терапии вызвана отсутствием стандартизированных и не слишком дорогостоящих технологий получения очищенных МСК и способов преодоления возрастного снижения их количества в органах и тканях [2].

Основным источником получения МСК для клеточной терапии служат собственные ткани взрослого человека: костный мозг, пуповинная кровь, зубчатое ядро гиппокампа, обонятельная луковица и субэпендимальная зона латеральных желудочков, дентальная пульпа, эпителий роговицы, жировая ткань и эндометрий [3, 4]. Наиболее максимальное число стволовых клеток содержится в кордовой крови и в костном мозге новорожденного, а с возрастом их число уменьшается во всех тканях [5].

Цель настоящей работы – выбор оптимального источника получения аутологичного клеточного материала (костный мозг или жировая ткань) для дальнейшего использования в экспериментальных исследованиях.

Материал и методы

Объектом исследования являлись костный мозг и жировая ткань, полученные от 10 половозрелых крыс самцов линии Wistar, содержавшихся в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе со свободным доступом к воде. Все процедуры с животными выполняли в соответствии с международными правилами и нормами (European Communities Council Directives of 24 November 1986, 86/609/EEC). У животных после передозировки СО2-наркоза выделяли бедренную кость и, выполнив разрез кожи вдоль средней линии живота, собирали подкожную жировую ткань механическим способом. Из костного мозга бедренной кости крысы получали культуру мезенхимальных клеток ранее описанным способом [1].

Для получения стромально-васкулярной фракции (СВФ) жировую ткань промывали с равным объемом фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Строму ферментатировали 0,075% раствором коллагеназы в течении 30-60 мин при 37 °C. Для нейтрализации коллагеназы суспензию отмывали 1-2 раза средой DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) при центрифугировании 1200g в течение 10 мин. Полученный осадок содержал высокоплотный конгломерат клеток СВФ. Клеточный осадок ресупендировали в 160 мМ растворе NH4Cl, инкубировали 10 мин при комнатной температуре для разрушения эритроидных клеток. Дважды отмывали СВФ средой DMEM, как описано выше, после фильтровали через нейлоновую сетку с ячейками 100 мкм для удаления тканевого дебриса.

СВФ помещали в пластиковую посуду и инкубировали в течение суток в стандартной культуральной среде (DMEM, 10% ЭТС, 1% антибиотик/противогрибковой смеси). Периодически промывали ФСБ прилипший монослой для удаления эритроидных клеток и получали на выходе переработанный СВФ (пСВФ) в отличие от первоначального, полученного при выделении из жировой ткани. пСВФ поддерживали на стандартной культуральной среде без индукторов дифференцировки до субконфлуектного состояния культуры, периодически осуществляя пассажи прилипающих клеток, чтобы не доводить МСК до дифференцировки и созревания при достижении монослоя. После завершения культивирования с помощью красителя трипановый синий оценивали жизнеспособность полученных клеток.

Статистическая обработка полученных данных включала расчет среднего (М) и ошибки среднего (m).

Результаты исследования

В результате культивирования мононуклеарных клеток костного мозга крыс были получены 10 культур МСК, образующих монослой на 12–14 сутки (рисунок). Жизнеспособность МСК после культивирования составила 89,2±8,4%. При экспансии культуры МСК, выделенных из пСВФ жировой ткани, жизнеспособность составила 93,1±5,4%.

 

А                                                              Б

Рисунок. Первичная культура мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из костного мозга крысы (А) и из жировой ткани крысы (Б). Темнопольная микроскопия. Увеличение х200

 

Сравнительный анализ двух источников для получения МСК – костный мозг и жировая ткань – продемонстрировал наилучшую эффективность по показателю выхода конечного продукта для жировой ткани (таблица). При этом клетки, полученные из костного мозга, также имели достаточно высокий потенциал жизнеспособности, но их содержание было значимо меньшим.

Таблица 1.

Показатели эффективности выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из разных источников

Источник клеток

Получаемый объем клеток

Доля адгезирующих клеток

Содержание МСК

Жировая ткань

до 30 мл

до 85%

> 5%

Костный мозг

до 0,5 мл

5-25 %, преимущественно клетки кроветворного происхождения

1-2%

 

Низкое число МСК требует их дальнейшей экспансии в условиях in vitro до достаточного числа для клинических приложений, что увеличивает риск контаминации, потери клеток, времени и расходов.

Заключение

Установлено, что из мононуклеарной фракции костного мозга и стромально-фаскулярной фракции жировой ткани лабораторных крыс в условиях in vitro были получены культуры мезенхимальных стволовых клеток с уровнем жизнеспособности более 85%, что свидетельствует об эффективности примененных методических подходов. Стромально-фаскулярная фракция жировой ткани обоснована, как оптимальный источник для получения мезенхимальных стволовых клеток, которые дальнейшем могут быть использованы в экспериментальных исследованиях, направленных на решение задач регенеративной медицины.

 

Список литературы:

  1. Влияние скеффолда с мезенхимальными стволовыми клетками на восстановление после длительного вибрационно-шумового воздействия у крыс / О.Б. Жукова, К.В. Зайцев, А.А. Гостюхина и др. // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2017. – № 12-1. – С. 59-62.
  2. Онищенко, Н.А. Клеточные технологии и современная медицина / [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.sdoctor.ru/patient/section/kletochnye_tekhnologii_i_sovremennaya_meditsina/ (дата обращения: 01.09.2018)
  3. Andersson, E.R. Regenerative medicine: a 2009 overview / E.R. Andersson, U.J. Lendahl // Journal of Internal Medicine. – 2009. – Vol. 266, № 4. – P. 303-310. DOI: 10.1111/j.1365-2796.2009.02157.x.
  4. Harnessing the mesenchymal stem cell secretome for the treatment of cardiovascular disease / Ranganath S.H., Levy O., Inamdar M.S. et al. // Cell Stem Cell. – 2012. – Vol. 10, № 3. – P. 244–258. DOI: 10.1016/j.stem.2012.02.005.
  5. Potency assay development for cellular therapy products: an ISCT review of the requirements and experiences in the industry / Bravery C.A., Carmen J., Fong T. et al. // Cytotherapy. – 2013. – Vol. 15. – P. 9-19.